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              服務熱線

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              基因編輯類型

              基因編輯類型

              根據研究的不同目的,需要制備不同的的動物模型。當為了研究基因的功能時需要過表達或敲除相應基因。如果全身敲除目的基因會導致動物死亡時,或需要在特定的組織敲除基因時,可以制備條件敲除小鼠。為了建立基因突變模型時,制備點突變動物模型。制備基因人源化小鼠時,可以進行人源基因的替換。制備不同的動物模型,需采用相應的策略,才能成功獲得目標模型。

              全身性敲除

              基因敲除是研究基因功能的重要方法。傳統ES打靶敲除方法,周期長,費用高。CRISPR/Cas9在基因敲除方面的優勢:效率高,時間短,24天直接獲得基因敲除小鼠。


              技術一般的流程

              設計合成gRNA→ 顯微注射→ 小鼠出生檢測。


              技術優勢或適合應用的研究

              -效率高,可達90%的敲除效率,并且有一定純合敲除比例。

              -方便檢測,從PCR條帶的大小,容易區分是否發生敲除。

              -時間短,24天獲得基因敲除小鼠。

              -不受敲除片段大小限制,從幾十bp到Mb長度的DNA,都能有效敲除。


              成功案例


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              圖1:兩個Grna切割位點之間的~550bp基因序列被敲除,PCR檢測,相對于野生帶773bp,發生敲除的鼠產生~220bp的條帶(箭頭指向的條帶)。


              ?條件性敲除

              當基因敲除會導致小鼠死亡時,需要條件敲除,才能獲得成體小鼠用于研究。條件敲除一般使用Cre-loxp系統,其方法是在基因的關鍵區域的兩側,插入loxp。loxp小鼠制備好后,與Cre小鼠雜交,獲得loxp純合,Cre陽性的小鼠,這種小鼠在Cre的作用下,loxp發生重組,中間的序列被刪除,達到敲除基因的目的。目前已經有數百種Cre工具小鼠,可以根據研究需要,購買或定制Cre工具鼠,在不同的組織器官,達到敲除目的基因。Cre融合ER/ERT2后,可以使用tamoxifen調控Cre入核,實現時間上的調控刪除。


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              圖1:通過CRISPR輔助,在關鍵外顯子的兩側通過同源重組,插入兩個loxp,在Cre的作用下,loxp之間的外顯子被刪除,實現基因條件敲除。


              技術一般的流程

              打靶載體設計→ 載體構建→ 顯微注射(EPS打靶)→ 小鼠鑒定。


              技術優勢或適合應用的研究

              -用于敲除致死的基因

              -非致死基因,用條件敲除也可以在不同的組織,不同的時間敲除基因,獲得更多的實驗數據。


              成功案例

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              圖2:在關鍵外顯子或非3整數倍的外顯子兩側敲入loxp,在Cre的作用下,該區域被刪除,導致基因敲除。


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              圖3:設計Loxp插入位點的特異引物與同源臂外側的引物,通過PCR,可以檢測到兩個loxp被正確敲入到目的位置,證明獲得條件敲除小鼠。



              隨機轉基因

              隨機轉基因是一種經典的過表達基因小鼠制備策略,不同于靶向基因編輯,沒有受到新興基因編輯技術的影響。該方法通過將基因隨機整合到基因組中,實現目的基因過表達。


              技術一般的流程

              過表達載體構建→ 顯微注射→ 小鼠鑒定篩選→ 表達檢測→ 品系建立。


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              圖1:轉基因載體和小鼠制備流程。


              技術優勢或適合應用的研究

              -可以廣譜,或組織特異過表達目的基因。

              -多拷貝插入,比定點插入表達量更高。

              -受整合位置影響,可能表達沉默,或者表達譜錯誤。


              成功案例

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              圖2:通過轉基因載體特異的引物設計,檢測到轉基因陽性的小鼠,一般效率在10-20%。


              定點轉基因

              定點轉基因是將轉基因表達載體敲入到Rosa26位點,該位點被證明是在所有組織細胞都活躍的區域,不會發生隨機轉基因中出現的轉基因沉默的現象。常用來制作過表達或條件過表達小鼠。條件過表達是在目的基因前面插入loxp包圍的Stop序列,阻止目的基因表達。該小鼠模型與Cre小鼠雜交,能夠在Cre表達的組織中,刪除Stop序列,從而使目的基因發生表達;過表達小鼠直接獲得組成性基因表達小鼠。維通達的Rosa26位點的定點轉基因系統,已經實現長達10kb的定點轉基因。


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              圖1:Rosa26位置敲入轉基因表達載體,制備定點轉基因小鼠.



              基因敲入

              基因敲入是指在基因組的特定位置插入一段DNA序列,例如給基因加GFP熒光標簽標記蛋白,原位敲入制備Cre工具鼠等應用。1kb以下的小片段插入,CRISPR/Cas9效率較高。對于大片段的基因插入,需要使用ES,或者EPS制備策略才能保證項目周期和效率。


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              圖1:把綠色熒光蛋白敲入目的基因的C端,融合表達,示蹤目的基因。


              技術一般的流程+圖解

              打靶載體設計→ 載體構建→ 顯微注射(EPS打靶)→ 小鼠鑒定。


              技術優勢或適合應用的研究

              -CRISPR用于小片段的基因敲入。

              -ES/EPS用于大片段基因敲入。

              -給基因加各種標簽,原位敲入制備Cre工具鼠。


              基因替換

              基因替換指,根據研究需要,將小鼠的基因替換為其它物種的基因??梢詫⒒虻牟糠止δ軈^,或者全基因進行替換。1kb以下的小片段替換,可以采用CRISPR/Cas9策略。對于大片段的基因替換,需要使用ES,或者EPS制備策略才能成功。


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              圖1:用其它種系的基因,替換小鼠的基因片段。


              技術一般的流程+圖解

              打靶載體設計→ 載體構建→ 顯微注射(EPS打靶)→ 小鼠鑒定。


              技術優勢或適合應用的研究

              -CRISPR用于小片段的基因替換。

              -ES/EPS用于大片段基因替換。


              3)基因人源化小鼠的制備,如PD1等免疫檢查點人源化小鼠的制備。


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              圖1 EPS小片段敲入效率高達90%。


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              圖2 EPS系統對于長達20kb的大片段敲入,也具有很高的效率。


              點突變

              許多疾病由氨基酸突變引起,為了構建此類疾病模型,可以將小鼠的對應基因的位點進行突變。單鏈DNA在點突變方面有較高的成功率。


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              圖1 單鏈DNA模板制備點突變小鼠。


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              圖2 PCR擴增包含突變位點的序列,測序檢測發生點突變的小鼠,目標堿基出現套峰,證明獲得雜合突變小鼠。


              技術一般的流程

              gRNA設計→ 供體DNA合成→ 顯微注射(EPS打靶)→ 小鼠鑒定。


              技術優勢或適合應用的研究

              -氨基酸突變類小鼠疾病模型模擬

              -CRISPR點突變效率相對較高



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